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                第二代高通量药物筛选平台更容易发现?#23383;?#37232;肌醇信号通路低亲合力抑制剂
                来源: Admin    更新时间: 2013-03-20    浏览: 1796 人次
                第二代高通量药物筛选平台更容易发现?#23383;?#37232;肌醇信号通路低亲合力抑制剂
                 
                 
                EJ Dell1, JL Tardieu2, F. Degorce2, Michael Fejtl1
                1 BMG LABTECH Inc. NC, USA [email protected]
                2 Cisbio Bioassays, 30200 Codolet, France

                 
                 
                关键词高通量药物筛选HTSHTRFCisbioBMG LabtechPHERAstar FS?#23383;?#37232;肌醇信号通路低亲合力,抑制剂,G-蛋白?#21058;?#21463;体,GPCRs
                 
                 
                摘要:
                 
                 
                 
                通过传统的高通量药物筛选平台(HTS)所发现的可市场化的药物不仅数量少,而且市面上大部分的药物都是小分子量(<500Da)物质。这似乎说明,运行于更低体积和更低浓度下的传统高通量药物筛选平台,错失了发现更低亲合力药物的机会。
                市场的需求催生了下一代高通量药物筛选平台——来自德国BMG LABTECH公司的PHERAstar FS,以光电倍增管(PMT)检测技术为核心的多功能微孔板检测仪。与来自另一品牌在行业中处于领导地位的以CCD相机为技术核心的微孔板检测仪进行平行测试。数据显示,PMT微孔板检测仪(PHERAstar FS)比CCD微孔板检测仪具有明显的性能优势:超过2倍的读数速度已经更加卓越的分析质量参数。更重要的是,PMT微孔板检测仪(PHERAstar FS)检测出几个CCD检测仪不能发现的更低亲合力的药物“靶点”。PHERAstar FS,作为新的高通量药物筛选的黃金标准,将是传统高通量药物筛选中用于发现低亲合力复合物的代表性选择。
                 
                数据显示,PMT微孔板检测仪与CCD微孔板检测仪相比:
                发现几个更低亲合力的药物“hits”(活性化合物)
                更好的Z’,分析窗和ΔF%
                2倍以上的检测速度
                 
                ?#36947;?#20998;析:
                 
                在这里,我们采用的是Cisbio公司生产的IP-One HTRF®分析——该方案检测更低应答的胞内第二信使磷酸肌醇(IP1),磷酸肌醇是三磷酸肌醇(IP3)的下游代谢产物。我们同时对比了两种不同的高通量筛选微孔板检测仪(PHERAstar FS和来自另外一个品牌的微孔板检测仪)对?#23383;?#37232;肌醇信号通路低亲合力抑制剂的检测结果来评估两种药物筛选技术。
                 
                背景知识:
                 
                G-蛋白?#21058;?#21463;体(GPCRs)为跨膜蛋白,是介导细胞外刺激信号的关键角色。GPCRs与胞内一系列复杂的复合物相互作用调控非常大量的下游效应物质。其产物三磷酸肌醇(IP3)是其中一个第二信使,是对Gq-蛋白?#21058;?#21463;体被激活的应答而产生的。然而,IP3的半衰期非常短,对于药物筛选而言,是很难对其进行测定的。因此,对由IP3触发的钙释放的监测,作为该信号通路的下游信号被广泛应用。另外一个监测IP3的方法是检测磷酸肌醇(IP1)的累积,磷酸肌醇(IP1)是三磷酸肌醇(IP3)的下游代谢产物。
                 
                图1.IP1的生物合成路径
                利用IP1的稳定性和在细胞内的可累积性的优点,采用IP1单克隆抗体制备优化的均相时间分辨荧光 (HTRF®)分析方法。HTRF® IP-One分析方法已经与多种现存的方法相比较?#19994;?#21040;相似的复合效能数据,且在终点累积的IP1可用于测定缓作用复合物的作用,这个是钙流测定没办法做到的。HTRF® IP-One分析方法同时可通过定量组成性激活的G蛋白受体来测定反向激动剂,这是测定钙释放的方法所不能做到的。最后一点,HTRF® IP-One检测方法具有比钙流检测方法更好的分析稳健度和更低的假阳性。IP-One分析方法是Cisbio Bioassays在其专利HTRF®技术上开发出来的。 (图2).
                 
                 

                该分析方法采用与IP1特异性结合的单克隆抗体,其原理是基于胞内累积的IP1与其竞争性结合从而抑制了HTRF®供体和受体之间的荧光共振能量转移(FRET)。建立一个IP1标准校正曲线可用于计算因复合物作用而引起的胞内累积的IP1的浓度,从而相应得到了复合物的浓度。
                2: IP-One HTRF 分析原理图
                 
                 
                材料和方法:
                 
                 
                 
                黑色1536-孔微孔板,来自于Greiner公司
                下一代PMT微孔板检测仪——PHERAstar FS,来自于德国BMG LABTECH公司
                高通量CCD微孔板检测仪来自于另外生产商
                PHERAstar FS配备高能脉冲氮分子激光,发射波长为337nm,同时配备了专用的同时双发射(SDE)直接光子测定时间分辨荧光模?#20581;?#24403;激发铽(Tb)受体分子时,激光比宽光波段的氙闪灯具有更高的效率。与铕(Eu)相比,激光的高能量使得激发峰在337nm左右的铽穴合物有更高的分子激发效率。Greiner的1536-孔微孔板用于5μL体系的分析。如图3所示,1408个不同的复合物移液到微孔板的前44列中,阳性对照(POS,n=64)和阴性对照(NEG, n=64)移液到最后4列中。
                 
                 
                图3: BMG LABTECH多功能酶标仪PHERAstar FS
                图4: 1536-孔微孔板布局
                 
                 
                结果与讨论:
                 
                 
                 
                通过计算两个发射波长(Em 665 nm / Em 620 nm) 下的HTRF®比率来评估分析结果, 1536微孔板的3维表面图的尖峰表示得到的hits(活性化合物)。
                 
                 
                图5: 用PHERAstar FS测得的IP-One HTRF® 比率
                图6: 用CCD微孔板检测仪测得的IP-One HTRF® 比率
                 
                 
                ?#20493;?#27604;同一块微孔板在两个仪器上读数结果时,很明显只有PHERAstar FS给出?#25628;?#24615;结果,而CCD微孔板检测仪并没有给出明显的尖峰。
                 
                 
                 
                PHERAstar FS
                CCD微孔板检测仪
                读数时间(1536孔微孔板)
                53秒
                2分12秒
                分析窗
                6:1
                2:1
                Delta F%
                490
                76
                Z’值
                0.70
                0.24
                 
                 
                结论:
                 
                 
                 
                用现有的处于领导地位的CCD微孔板检测仪不能发现的低亲合力复合物用PMT微孔板检测仪PHERAstar FS可以很容易的检测出来。
                 
                 
                相关介绍:
                 
                 
                HTRF: HTRF® 是均相时间分辨荧光技术的简称,HTRF® 技术是对TR-FRET技术的进一步改良,提供了更高的灵敏度和稳定性,为法国Cisbio公司的专利技术。Cisbio Bioassays是一家超过50年历史的生命科学、医疗诊断和药物研发公司。Cisbio Bioassays公司所销售的基于HTRF技术的产品包括:IP1, cAMP, Cellul’erk以及Tag-lite™细胞表面受体平台。在众多HTRF®的检测仪器中,BMG LABTECHPHERAstar FSCisbio公司的推荐仪器。
                 
                 
                BMG LABTECHBMG LABTECH是一家超过20年历史的德国公司,多功能酶标仪是其唯一专注的产品,其多功能酶标仪以专业、高端而著称于市场,是科研和药物筛选的最佳选择。特别是FLUOstar Omega(荣获“2010年科学家的选择最佳药物筛选产品”)以及PHERAstar FSCisbio公司推荐HTRF®检测仪器)更是多功能酶标仪领域的骄子。香港伯齐科技有限公司为BMG LABTECH在中国大陆和香港、澳门的唯一授权代理商。
                 
                 
                采用Cisbio IP-OnePHERAstar FS相结合所发表的文章:
                 
                 
                 
                 
                 
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